软件的功能可以按照图0.1的红框内的选项卡大致分成四个部分：Data Exploration：查看数据的基本信息，包括光子时序图、E-S二维直方图等；Burst Analysis：对burst的各自特征进行统计；smFRET Analysis：对FRET效率分布进行校正及分析；Burst Variance Analysis:利用burst的方差分析样本是否存在动态的构象转换。

1.数据文件与数据读取、输出

1.1数据文件

软件读取的数据文件仅为“Correlation Acquisition V4.0”在”Single Molecule”模式下采集数据后，保存的*.mat文件。

1.2读取文件

在读取文件前，需要将文件放入“File List”区域（图1.1的红框所示），有以下两种方法：

图1.1 File List

1.导入单个文件：点击菜单栏“File->Open File”，图1.2，然后选择一个数据文件“*.mat”，点击打开后，“File List”将出现该文件。

2.导入文件夹中所有文件：点击菜单栏“File->Open Folder”，然后选择一个存放数据文件的文件夹，选中文件夹后，“File List”将出现文件夹中所有“*.mat”文件。

双击“File List”中任意一个文件，软件出现读取数据的进度条，正在读取数据，完成后，Data Exploration模块会显示数据的基本信息，若文件中的数据不合乎要求，软件将弹出读取数据失败的提示。

图1.2 File 菜单栏

1.3文件保存与输出结果

数据在分析完成后，可以将分析结果保存到“*.mat”文件中，具体操作为：在菜单栏点击“File->Save”，用户此时需选择保存路径和填写保存文件名，软件为另存的新文件提供默认命名，即原文件名后加上“_analyzed”。保存成功后，会出现“Save completed!”的提示，该文件中保存了用户“burst search”，“burst correction”等分析结果。

除了将结果保存到“*.mat”文件外，数据也可以导出到excel表格，点击“File->Export”，可以将分析得到的bursts数据导出到“*.xlsx”文件中。保存成功后，会出现“Save completed!”的提示，excel表格中保存的内容如图1.3所示。

图1.3 excel表格中保存的bursts数据

2.数据勘探

2.1简介

数据勘探(Data Exploration)模块是软件启动时显示的默认模块，主要功能是让用户在读取数据后马上了解数据的整体情况，如图2.1所示，数据勘探模块主要显示3个部分的信息：区域1的光子时序信号（time-trace）展示样品发光强度及大致的浓度水平；区域2展示样品的背景信号的水平；区域3的E-S二维直方图展示样品的FRET效率和标记情况。

2.1数据勘探界面

2.2光子时序信号图

光子时序信号图显示三个通道的荧光信号随时间的变化，分别用三种颜色的曲线表示，如图2.2图。

绿色：DexDem，由donor激光器激发，donor探测器接收到的信号。

红色：AexAem，由acceptor激光器激发，acceptor探测器接收到的信号。

蓝色：DexAem，由donor激光器激发，acceptor探测器接收到的信号。

光子时序信号图的纵轴是光子计数(counts)，指一个bin time内某个通道探测到的光子数，bin time的默认值是1ms，也可以在上方的“Time-Trace Setting”中的“Bin Time (ms) ”编辑框中由用户自由设定。

光子时序信号图的横轴的显示的默认时长是1s，用户可以在下方的“Duration (s)”编辑框中改变显示时长。拖动图2.2橙色框中的滑动条，可以调整光子时序信号图的时间位置。

图2.2 光子时序信号图

“Time-Trace Setting”右边有个复选框“Show Bursts”，若点击选中，光子时序信号图中会用虚线标示出每一个burst的位置，如图2.3，其中黑色虚线标记的是burst开始的位置，而蓝色虚线标记burst结束的位置。Burst是荧光分子经过聚焦体积时，探测器突然接收到大量光子，在图中表现出一个尖峰信号。当样品的浓度处于单分子水平时，1s内通常出现1~5个burst。

图2.3 光子时序信号图中显示burst的位置

2.3背景信号

背景信号是一段时间内burst信号以外的光子信号的平均亮度，这段时间由采集过程中设置的单段采集时长决定。背景信号在读取数据后由软件自动计算，若将光子时序图的bin time调节为一个合适的值(一般大于10ms)，可以明显看到三条水平虚线，分别位于对应颜色的光子计数曲线的底部，显示每个通道的背景信号水平，图2.4。

图2.4 Time Trace图中的水平虚线显示各个通道的背景信号

在Time Trace图的下方，“Background”区域，展示更详细的关于背景的信息。

“Background”区域左方，Photon Delays图用于计算一段时间内三个通道的平均背景光子率，图2.5左侧。横坐标Inter-Photon Delays (ms)，指两个连续光子的时间间隔，时间间隔的定义由式2-1给出，是探测器探测到第i个光子的时刻。纵坐标Delays (counts)统计时间间隔的出现频率。

(2-1)

若样品中不存在荧光分子，探测器在单位时间内接收背景的光子数服从泊松分布，单位时间内平均光子数可以由式2-2给出：

(2-2)

式中代表单位时间内平均光子数，即平均光子率，是平均时间间隔。

若样品中存在少量荧光分子，中包含了由荧光所贡献的部分，此时统计平均背景光子数必须将这部分去除，考虑到荧光比起背景噪声在单位时间发出更多的光子，即荧光光子的间隔时间要远小于噪声光子。定义一个时间阈值tail time，当是源于荧光光子，当>tail time时，则源于背景噪声光子，因此式2-2修改为：

(2-3)

式2-3，给出了由时间间隔计算背景光子率的方式，三个通道各自的背景光子率在图例中标示。

在“Segment”中，用户可以切换显示某一个时间段内背景光子率。

“Tail Time (ms)”编辑框，用户可以在这里设定式2-3中的tail time，重新计算背景光子率，默认状态填入“Auto”，表示由软件自行确定tail time。

Photon Delays图展示了一段时间三个通道的背景光子率，而“Background”区域右方，T-BG图则显示整个实验三个通道的背景光子率随时间的变化，图中每一个点对应了Photon Delays图一个segment的背景光子率。

图2.5 Background

2.4 E-S二维直方图

E-S二维直方图是基于每一个burst（图2.3）的FRET-efficiency和stoichiometry值统计得到的。

FRET-efficiency和stoichiometry分别由式2-4和式2-5确定。

(2-4)

(2-5)

式中、、分别是一个burst中来自DexDem、DexAem、AexAem通道的光子数，γ和β是两个修正系数，将在4.4节中详细讨论。

图2.6的E-S二维直方图共统计了6440个bursts的FRET-efficiency和stoichiometry值(右上角Total Bursts所示)，上方是FRET-efficiency直方图，右方是stoichiometry直方图，中间是FRET-efficiency和stoichiometry的联合分布直方图。

Bursts可以根据stoichiometry划分为三种类（图2.6）：

1.stoichiometry值在0.8~1.2之间(绿框部分)，由式2-5，这些bursts的值很小，而是源于acceptor荧光分子的信号，说明这些分子无标记acceptor荧光分子，即属于donor-only的样品。

2.stoichiometry值在-0.2~0.2之间(红框部分)，由式2-5，这些bursts的值要远大于值，而、是源于donor荧光分子的信号，说明这些分子无标记donor荧光分子，即属于acceptor-only的样品。

3.stoichiometry值在0.2~0.8之间(黄框部分)，这些bursts的值和值相当，这部分数据是由同时标记了donor、acceptor荧光分子的分子产生的。

图2.6 E-S 二维直方图

2.5 Burst Search

Burst Search是从光子时序信号中提取出bursts的程序，软件读取数据时，会自动执行一次Burst Search，用户也可进行自定义的Burst Search。点击E-S 二维直方图上方的“Burst Search”按钮，会弹出Burst Search设置的对话框。

图2.7 Burst Search设置界面

可以设置的参数如下：

M：窗口大小，burst search通过一个滑动的观察窗口，在光子时序信号上依次观察每M个连续的光子，若某连续M个光子的光子率(cps)很高，则这M个光子识别为burst信号，因此，一个burst的至少包含M个光子。若M设置为一个较大的值，有可能将几个紧连的burst识别为一个burst，如图2.8。请将M设置为一个大于2的整数。

图2.8 M值对burst search的影响。左图M=10，将图中信号识别为两个burst，右图M=30，将图中信号识别为单个burst

F：比较阈值，当窗口内连续M个光子的光子率(cps)大于背景光子率的F倍时，这M个光子被认为是处于一个burst上。请将F设置为一个大于1的数。

BG Correction：是否对burst进行背景信号修正，若勾选此项，burst的光子数将减去背景信号的光子数。

Fixed BG Rate: 由用户提供一个固定的背景光子率，取代软件计算的背景光子率，来执行burst search，默认为“None”，表示使用软件提供的背景光子率。

Channel：用户选择哪些通道参与burst search，只有选中通道的光子才会出现在滑动窗口中；没有选中的通道的光子数对burst search中的阈值比较没有影响，但burst search完成后，没有选中的通道的光子也计入burst中。

参数设置完成，点击”OK”开始burst search。

2.6 Burst Selection

Burst Selection是对burst search提取的bursts实行进一步的筛选，用户可以通过E-S二维直方图下方的三个滑动条或编辑框来设置3个阈值来实现bursts的筛选。

图2.9 Burst Selection设置滑动条

: 对burst的总光子数设置一个下限，小于这个阈值的burst将被筛除，设置该值可以去除那些非荧光信号。

: 对burst中由donor荧光分子贡献的光子数设置一个下限，设置该值，可以去除那些没有donor荧光分子标记的信号（即去除acceptor-only的信号）。

：对burst中由acceptor荧光分子贡献的光子数设置一个下限，设置该值，可以去除那些没有acceptor荧光分子标记的信号（即去除donor-only的信号）

设置不同的参数对E-S二维直方图的影响如图2.10。

图 2.10 设置不同阈值对E-S二维直方图的影响

(a) 设置阈值为 30，筛选后剩余6440个bursts；

(b) 设置阈值为 50, 筛选后剩余4118个bursts；

(d) 设置阈值为 50, 阈值为25，筛选后剩余2664个bursts，对比(b)图，左上方约1400个donor only的数据点被筛除了。

3.Burst 分析

3.1 简介

Burst分析模块主要功能是产查看burst的详细信息，在选项卡点击“Burst Analysis”可以将软件界面切换至Burst分析模块。下方的表格详细罗列了每一个burst的信息，上方的直方图是基于表格数据的统计图。

图3.1 Burst分析模块

3.2 表格

表格中每一行记录了一个burst的以下信息：

Start (s): burst开始的时刻。

Stop (s): burst结束的时刻。

Duration (ms): burst的持续时间。

Burst Size (counts): burst包含的总光子数。

Photon Rate (kcps): burst的光子率，即每秒探测到的光子数。

(counts)：一个burst中来自DexDem的光子数。

(counts)：一个burst中来自DexAem的光子数。

(counts)：一个burst中来自AexAem的光子数。

FRET Efficiency：burst 的FRET-efficiency，定义见式2-4。

Stoichiometry：burst 的stoichiometry，定义见式2-5。

3.3 直方图

直方图对Burst的几种性质进行统计，点击下方的”X”选框，可选择直方图的统计变量，如图3.2，点击右边的“log(x)”，直方图的横坐标变成对数显示。

图3.2 改变直方图的统计变量

直方图左方的“Y”选框可以改变直方图的归一化方式，分别为：

Bursts: 直接统计bursts的数量，默认值。

Probability：直方图概率归一化，选择此项时，直方图条形高度(Y值)之和为1。

PDF (Probability Density Function)：直方图概率密度归一化，选此项时，直方图条形面积之和为1。

CDF (Cumulative Density Function)：累积的密度函数的直方图，最后一个条形的高度小于或等于1。

图3.3 改变直方图的归一化方式

4.smFRET分析

4.1 简介

smFRET分析模块包含两个主要功能：Bursts修正和FRET构象分析。点击选项卡“smFRET Analysis”，界面将切换到smFRET分析模块，图4.1。

图4.1smFRET分析模块

4.2 Bursts修正

FRET实验中需要使用两种以上的荧光染料，不同的荧光染料之间存在信号串扰和发光效率、探测效率的差异，这些因素会在FRET-efficiency的分析中引入偏差，软件提供了修正这些偏差的方法，分四步执行，如图4.2。

第一步，请点击“Correction Steps”中第一个按钮“1. Load Data”，这将数据恢复到进行参数修正前的状态。

图4.2 bursts修正流程

4.2.1 Alpha修正

Bursts修正的第二步是alpha修正。

FRET实验要求donor荧光分子的发射光谱和acceptor荧光分子的激发光谱存在重叠，光谱的重叠使FRET存在系统的信号串扰，其中acceptor探测器接收的，由donor荧光分子发出的信号称为leakage信号，leakage信号的存在使得FRET信号强度偏高。

Alpha修正目的是消除leakage信号的影响，原理是对光子数减去一部分可能源于leakage信号的光子数，如式4-1：

(4-1)

上式α系数定义为：

(4-2)

式中为仅标记了donor荧光分子的样品在donor激光器激发下，donor通道探测到的荧光强度；为该样品在donor激光器激发下，acceptor通道探测到的荧光强度。为了获取α系数，可以进行额外实验或使用软件计算。

额外实验需要准备仅标记了donor荧光分子的样品，添加样品后，打开donor激光器，同时打开donor、acceptor通道的探测器，记录这两个通道的平均荧光强度、，由式4-2可算得到α系数，之后，在“Correction Coefficient”的“Alpha”编辑框中输入这个结果。

而在软件中执行alpha修正的方法是，当E-S二维直方图中存在donor-only的数据集群时（参考2.4节），点击“2. Alpha Correction”按钮，E-S二维直方图中会出现一个红色虚线的方框(一般位于stoichiometry值为0.8~1的位置）。用户可以通过改变“Boxed Area”中四个参数，或点击E-S二维直方图下方的红色方框按钮后，在图中拖动鼠标，来改变红色虚线的方框的位置及大小，当红色方框刚好包围全部donor-only的数据集群时，软件计算出alpha系数，如图4.3中算得当前的alpha系数为0.12。

图4.3 Alpha 修正

4.2.2 Delta修正

Bursts修正的第三步是delta修正。

FRET 实验中，acceptor荧光分子有可能直接被donor激光激发，发出称为dir-excitation的信号，和leakage信号相似，dir-excitation的存在也会导致FRET信号强度偏高

Delta修正目的是消除dir-excitation信号的影响，原理是对光子数减去一部分可能源于dir-excitation信号的光子数，如式4-3

(4-3)

式(4-3)的δ系数定义为：

(4-4)

式中为仅标记了acceptor荧光分子的样品在donor激光器激发下，acceptor通道探测到的荧光强度；为该样品在acceptor激光器激发下，acceptor通道探测到的荧光强度。为了获取δ系数，可以进行额外实验或使用软件计算。

额为实验需要准备仅标记了acceptor荧光分子的样品，添加样品后，打开donor激光器，打开acceptor通道的探测器，记录此时的平均荧光强度，然后关闭donor激光器，打开acceptor激光器，记录此时的平均荧光强度，由式4-4算得δ系数，之后，在“Correction Coefficient”的“Delta”编辑框中输入这个结果。

在软件中执行delta修正方法是，当E-S二维直方图中存在acceptor-only的数据集群时(参考2.4节)，点击“3.Delta Correction”按钮，E-S二维直方图中会出现一个红色虚线的方框(一般位于stoichiometry值为-0.2~0.2的位置）。用户可以通过改变“Boxed Area”中四个参数，或点击E-S二维直方图下方的红色方框按钮后，在图中拖动鼠标，来改变红色虚线的方框的位置及大小，当红色方框刚好包围全部acceptor-only的数据集群时，软件计算出delta系数，如图4.4中算得delta系数为0.08。

图4.4 Delta 修正

4.2.3 Gamma修正

Bursts修正的第四步是Gamma修正。

Donor、acceptor荧光分子的量子效率及它们被探测器探测的效率存在差异，在计算FRET-efficiency时(式2-4)，通过引入γ系数来抵消这些差异：

(4-5)

式中、分别是donor、acceptor荧光分子的量子效率，、分别是donor、acceptor荧光分子被探测器接收的效率。

软件中Gamma修正流程如下：点击“4.Gamma & Beta Correction”按钮，此时弹出一个提示框，图4.5，提示用户需要选择同时标记两种荧光分子（参考2.4节），并且至少存在两种FRET-efficiency（如图4.6的FRET-efficiency直方图中存在两个高斯峰）的数据集群。使用红色方框确定数据区域后，软件计算出gamma、beta系数，图4.6。

图4.5 Gamma 修正提示

图4.6 gamma 修正

图4.6中，红色方框中的红色曲线由式4-6给出，式4-6通过拟合两个种类以上FRET-efficiency的数据点估计γ、β系数。

（4-6）

上式中的β系数表明实验中donor、acceptor激光的功率情况，当donor激光功率对于acceptor激光功率偏高时，β<1，E-S二维直方图数据整体往上偏移，当acceptor激光功率对于donor激光功率偏高时，β>1，E-S二维直方图数据整体往下偏移。

4.2.4 ROI模式与修正检验

经过Alpha、Delta、Gamma修正后，Alpha、Delta、Gamma、Beta系数的计算结果都在“Correction Coefficient”中列出，用户也可以直接在编辑框中直接输入或修改这些修正系数。点击“Apply”按钮，软件将使用Alpha、Delta、Gamma、Beta系数的当前值来进行burst修正，并自动筛除donor-only及acceptor-only的数据，如图4.7左。点击“Reset”按钮，数据将恢复到修正前的状态，图4.7右。

图4.7 （左）修正后（右）恢复到修正前

点击“ROI”按钮，smFRET分析模块将切换至ROI模式，在ROI模式下，使用“Boxed Area”来选中数据区域将不会更新任何修正系数，用户点击E-S二维直方图下方的红色方框按钮，或在“Boxed Area”中修改参数来查看E-S二维直方图中任意部分的数据。

修正检验：

在ROI模式下，可以通过选中donor-only、acceptor-only部分的数据来验证修正结果是否可靠，为此，要保证当前存在 donor-only及acceptor-only的数据：点击左下角的“Burst Selection”，在对话框中将的阈值去除，将的阈值去除，如图4.8左，点击“OK”后关闭对话框；E-S二维直方图中恢复了donor-only及acceptor-only的数据，图4.8右。

图4.8 （左）设置“Burst Selection”以恢复donor-only及acceptor-only的数据（右）恢复了donor-only及acceptor-only的数据的E-S二维直方图

(1)验证alpha修正：

对于donor-only的样品，其光子数来源于leakage信号，若alpha修正的结果正确，这部分光子数应修正为0，由式2-4可知，此时FRET-efficiency也接近0。因此，在E-S二维直方图选中donor-only的部分（如图4.9红色虚线方框选中的部分），选中后，查看FRET-efficiency直方图的峰值位置，若直方图在在0附近达到峰值，说明alpha修正准确（如图4.9中黄色方框提示，可以在“Fitting Models”中选择“One Gaussian”，此时软件会对直方图进行单高斯拟合，查看右侧的“Fitting Result”的“Center参数”，进一步确认FRET-efficiency的峰值位置）。

图4.9 验证alpha修正

(2)验证delta修正：

对于acceptor-only的样品，它的光子数来源于dir-excitation的信号，若Delta修正的结果正确，光子数修正为0，另外，acceptor-only样品的光子数也为0，由式2-5可知，经过delta修正后stoichiometry值为0。因此，在E-S二维直方图选中acceptor-only的部分（如图4.10红色虚线方框选中的部分），选中后，查看stoichiometry直方图的峰值位置，若直方图在0附近达到峰值，说明delta修正准确（如图4.10中黄色方框提示，可以在“Fitting Models”中选择“One Gaussian”，查看右侧的“Fitting Result”的“Center参数”，进一步确认stoichiometry的峰值位置）。

图4.10 验证delta修正

(3)验证gamma修正

若gamma、beta系数的计算正确，对于拥有不同FRET-efficiency的样品，它们的stoichiometry应都等于0.5。在E-S二维直方图选中同时标记了两种荧光分子的部分（如图4.11红色虚线方框选中的部分），选中后，选中后，查看stoichiometry直方图的峰值位置，若直方图在0.5附近达到峰值，说明gamma修正准确（如图4.11中黄色方框提示，可以在“Fitting Models”中选择“One Gaussian”，查看右侧的“Fitting Result”的“Center参数”，进一步确认stoichiometry的峰值位置）。

图4.11验证gamma修正

4.3 FRET构象分析

在经过系数修正后，可以获得比较准确的样品的FRET-efficiency分布信息。由于感兴趣的往往是只标记两种荧光分子的样品的数据，可以在ROI模式下选中感兴趣的数据区域，或者使用“Burst Selection”设置阈值来筛除donor-only、acceptor-only的数据。

在FRET-efficiency直方图上方的Fitting Model选框中可以选择“One Gaussian”、“Two Gaussians”、“Three Gaussians”模型来拟合直方图数据。右方的“Fitting Result”显示当前一次拟合的结果，图4.12。

图4.12 选择拟合模型拟合直方图

其中的参数解释如下：

Root Mean Square Error：直方图和拟合模型的拟合残差的平均平方根

Chi Square: 拟合误差的卡方值

Center: 单高斯分布的峰值横坐标，括号的内容为95%置信区间。

Sigma: 单高斯分布的标准差，括号的内容为95%置信区间。

Amplitude：当前一个高斯峰的面积占比（单高斯模型无此参数），括号的内容为95%置信区间。

在FRET-efficiency直方图上方存在一个R₀ (nm)编辑框，用户如果在此输入荧光染料的Förster半径，软件按式4-7将FRET-efficiency转化为荧光染料之间的距离R，FRET-efficiency直方图将转换为距离R的直方图，图4.13。

图4.13 转换为距离R的直方图

（4-7）

由式4-7可知，当荧光染料之间的距离R等于Förster半径R₀时，FRET-efficiency为0.5；且FRET-efficiency随着距离R的增大而快速下降。

5.BVA

5.1 简介

Burst Variance Analysis(BVA)是一种分析FRET分布是否存在动态转换的方法，其主要想法是将一个burst分割为若干个连续的子bursts（sub-bursts）,每个sub-burst由n个、光子组成（光子不计入这n个光子）。这些sub-bursts中与n的比例称为，式5-1，将的标准差于与理论散粒噪声的极限(theoretical shot-noise-limited standard deviation)标准差对比，若的标准差大于理论值，说明FRET的波动是FRET构象的动态转换造成。

(5-1)

若一个burst的构象稳定，其内在的FRET效率为，则其内部任意n个连续的光子中，光子数服从期望值为的二项分布，式5-2：

(5-2)

的标准差理论值由式5-3给出：

(5-3)

5.2 BVA

BVA需要burst中的光子数未经过任何修正，并且不包含donor-only、acceptor-only的数据，软件在读取数据后自动对数据进行处理，使其适用于BVA，用户在选项卡点击“Burst Variance Analysis”可以将软件界面切换至BVA模块：

图5.1 BVA结果

图5.1下方-σ分布图反映了每个burst的的标准差及分布情况，左侧的编辑框n让用户改变sub-burst的大小，黑色的半圆弧虚线是式5-3给出的的标准差理论值分布，红色三角形的高度代表一个区域内的标准差的平均值，若红色三角曲线明显处于黑色虚线上方，说明实际的波动超出理论值，FRET构象可能存在动态变化。

BVA模块中提供了同Data Exploration模块相似的Burst Search及Burst Selection功能，BVA模块使用的数据独立于其它三个模块，因此调节Burst Search及Burst Selection的参数不会影响其它三个模块的数据。

附录

图像通用功能介绍

软件中所有的图像都适用以下功能：放大（zoom in）、缩小（zoom in）、拖动（pan）、数据游标（data cursor）、保存（save）。

图1. 图像工具栏，位于菜单栏下方，从左到右分别是放大、缩小、拖动、数据游标四个工具

放大：点击按钮，进入图像放大模式，此时鼠标移动到任意图像上时，将变成十字样式，用户按住鼠标左键，拖动鼠标，图像中将出现一个虚线方框，放开鼠标左键，方框内的部分将放大到整个图像。在放大模式下，右击鼠标，出现一个菜单，图2，由上至下分别是缩小（点击后图像缩小一个规模）、恢复到原图像（点击后恢复到原图像）、自由放大（默认的放大模式）、水平缩放（点击后进入水平缩放模式，此模式下单击或滑动鼠标滚轮仅在水平方向放大或缩小图像）、垂直缩放（点击后进入垂直缩放模式，此模式下单击或滑动鼠标滚轮仅在垂直方向放大或缩小图像）。在放大模式下，点击按钮，退出放大模式。

图2. 放大模式下的右击菜单

缩小：点击按钮，进入图像缩小模式，此时鼠标移动到任意图像上时，将变成放大镜样式，点击鼠标左键，以点击位置为中心缩小图像，若图像是原尺寸大小，则无效。在缩小模式下，点击按钮，退出缩小模式。

拖动：点击按钮，进入图像拖动模式，此时鼠标移动到任意图像上时，将变成手样式，用户按住鼠标左键，拖动鼠标，图像会随鼠标移动。在拖动模式下，右击鼠标，出现一个菜单，图3，恢复到原图像（点击后恢复到原图像）、自由拖动（默认模式）、水平拖动（点击后进入水平拖动模式，此模式下只能水平拖动图像）、垂直拖动（点击后进入垂直拖动模式，此模式下只能垂直拖动图像）。在拖动模式下，点击按钮，退出拖动模式。

图3. 拖动模式下的右击菜单

数据游标：点击按钮，进入数据游标模式，鼠标移动接近图像上的数据点时，变成十字样式，点击鼠标左键，该数据点的坐标将被显示，图4，用户此时可以点击键盘上的上下左右方向键，来控制数据点的位置。在数据游标模式下，右击鼠标，显示菜单，图5，由上至下分别是选择模式（可选由鼠标位置确定、由最靠近鼠标位置确定）、数据游标的显示方式（小窗口显示坐标、图上显示坐标）、新建数据游标（点击后可创建多个数据游标）、删除数据游标（点击后删除最新的数据游标）、删除所有数据游标、输出数据游标到工作空间（无效功能）、编辑文本升级函数（无效功能）、选择文本升级函数（无效功能）。在数据游标模式下，点击按钮，退出数据游标模式。